Bonjour,

dans toutes les analyses amplicons on a après le séquençage un nombre de
séquences espéré identique. Par exemple prenons le cas ou le sequenceur
nous donne 10 000 seq par echantillon. Ces 10 000 seq proviennent d'une
PCR à partir d'une concentration d'ADN normalisée. Le nombre de cibles
amplifiées dans cette PCR et duquel va résulter les 10 000 seq nous est
inconnu. On peut s'imaginer dans un echantillon donné avoir 1000 cibles
introduites avec l'ADN utilisé pour faire la PCR et dans un autre cas
avoir 5000 cibles.

Jusqu'à présent on doit donc travailler en proportion, pas en abondance.
Ce que j'aimerai donc c'est savoir que mon echantillon 1 provient de
1000 cibles amplifiées et que mon échantillon 2 provient de 5000 cible.
Ceci me permettrait de corriger ma table de données pour la transformer
en données quantitative.

L'idée est donc de faire de la qPCR contre standart en utilisant les
mêmes amorces que celle utilisées pour produire les amplicons à séquencer

On en reparle

Philippe

Le 06/12/2019 à 16:17, July a écrit :
> Bonjour Philippe,
>
> On se voit Lundi avec Romain et Sophie pour discuter de ta problématique concernant la « quantification »  des échantillons.
> J’ai noté quelques trucs quand tu as expliqué cela vendredi dernier mais cela reste assez flou sur ce que tu souhaites vraiment. Comme nous ne participons pas à l’analyse des données de séquençage, nous ne sommes pas au coeur même du problème rencontré !
>
> Ce qui te pose problème c’est que tu obtiens après séquençage, des échantillons avec un nb de reads très différents (3000 pour un ech. alors que l’autre va en avoir 40000) malgré une normalisation avant la PCR2 sur smartchip.
> Le fait est que, pendant cette PCR2, il y a en plus, plusieurs paramètres pouvant créer un biais et il n’y a pas de normalisation avant le Pool donc c’est un peu à l’aveugle mais c’est le principe du Smartchip après tout !
> Contrairement aux librairies DNA ou RNA où les quantités sont normalisées avant de faire la librairie et une nouvelle fois avant le séquençage.
>
> Je suppose que :
> statistiquement, l’analyse inter-run et intra-run est difficile puisque tu ne peux pas savoir si la différence en nb de reads est due à un différentiel d’expression lié à l’échantillon, la qualité de l’échantillon, un biais de PCR ou de séquençage. De plus, je suppose que comparer ou présenter des résultats à partir d'un échantillon avec 3000 reads et un autre avec 40000 reads ce n'est pas très « significatif »
>
> Tu souhaiterais donc intégrer un standard (au nb de copies connues) qui te permettrait de normaliser tes résultats de séquençage ?
> cad trouver un système permettant de faire une relation entre : le rendement de la PCR 2 (nb de copies obtenues/nb de copies initiales) et le nb de reads à l’issu du séquençage
>
> A quel moment ce standard devrait il être intégré ? pendant cette PCR 2 Amplicon justement ?
>
> Du coup, plutôt un standard interne intégré à chaque échantillon qui le suivra de la PCR2 au séquençage ? il devra être en petite quantité pour ne pas perturber l’échantillon ou prendre sa place.
>
> Bref, dis nous en + !
>
> July