Standard qPCR gblocks

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Début : 12/2019

Fin :

Recherche d’un standard pour qPCR

Exemple de Formulaire pour les Projets DEV. Tous documents/liens jugés nécessaires par le personnel en charge du projet peuvent y être ajoutés.

Contact/Date/Coordonnées : Philippe VDK

Demande (application, techno, protocole, échantillons, …) : 

Pour ses travaux et ceux de ses doctorant(e)s, axĂ© sur les amplicons 16S et 18S, PVDK souhaite connaĂ®tre le nombre de cibles dans l’Ă©chantillon Ă  partir duquel il obtient son nombre de reads au sĂ©quençage. PVDK a prĂ©sentĂ© le principe lors de rdv en rĂ©union mais Ă©galement par mail. Cela leur permettrait donc de faire une correction en bioinfo, sachant que le nombre de reads obtenus a tendance Ă  fluctuer. PlutĂ´t que de se baser sur le nombre de reads (et donc partir du principe que + de reads = + de cibles donc + d’abondance de l’sp.), ils pourront corriger leurs tables en normalisant le nombre de reads en fonction du nombre de cibles initiales qui sera alors connu.

Fiche contact/Type de contrat (si applicable) : Le standard sera appliqué dans divers projet VANPH ou MOCEN dans un premier temps.

Faisabilité : Oui. L’utilisateur doit cependant nous fournir une sĂ©quence 16S et une sĂ©quence 18S.

CoĂ»t estimé : Les renseignements de HEMJU ont permis d’arrĂŞter un choix sur les gblocks proposĂ©s par IDT. Les gblocks sont en fait des standards dans des concentrations connus qui sont synthĂ©tisĂ©s par IDT. Le coĂ»t varie selon la taille. Il semblerait que nous partions sur des gblocks de 500-750 bp, soit 120 euros le standard.

https://eu.idtdna.com/pages/products/genes-and-gene-fragments/double-stranded-dna-fragments/gblocks-gene-fragments

Devis/Fiche d’engagement (si applicable) : nan

Project Plan/Date envisagée :

 

09-10/09/2021:

MOCEN compte rĂ©aliser un projet de smartchip avec gblocks. VANPH nous a transmis une sĂ©quence. Nous allons commander cela chez IDT, sous la forme d’un unique standard qui couvrira la zone AMF et la zone FG.

voici la séquence à commander:

GAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTTGGCCTGGCTGGCAGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTTGTCCCTTCCTGAAGAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGGAAACAGGACTGTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTTAAAGCAAGCTAACGCTTGAATACATTAGCATGGAATAATGAAATAGGACGATCGATCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGATTGACGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTACGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTGACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGATGATGTTAATTTTATAATGACTCATTTGGCGCCTTACGGGAAACCAAAGTGTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGcTTAATTCCGATA

En annexe de cette fiche dev se trouve le fichier reprenant toutes les informations et la localisations des primers.

MICSO va contacter Nolan Talhi d’IDT pour obtenir un cadeau sur ce gblocks.

A reception nous penserons Ă  tester la gamme avec quelques Ă©chantillons que MOCEN doit nous amener.

 

13/09/2021:

Extrait rĂ©ponse de Nolan: “Nous conseillons de rajouter au minimum 15 nuclĂ©otides de part et d’autre afin d’éviter une dĂ©gradation du gBlocks au fil des congĂ©lations / dĂ©congĂ©lations.
Vous pouvez effectivement bĂ©nĂ©ficier d’un gBlocks gratuit < 1,000 pb. ‘

Soit on commande la séquence:

CTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTTGGCCTGGCTGGCAGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTTGTCCCTTCCTGAAGAACCGTAATGCCATTAATTTGGTGTTGCGGGGAAACAGGACTGTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTTAAAGCAAGCTAACGCTTGAATACATTAGCATGGAATAATGAAATAGGACGATCGATCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGATTGACGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTACGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTGACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGATGATGTTAATTTTATAATGACTCATTTGGCGCCTTACGGGAAACCAAAGTGTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTCCGATAACGAACGAG

 

27/09/2021:

Standard reçu.

Il est prévu de resuspendre les 1000ng dans 102,1µL au lieu de  100µL pour obtenir un mélange final à 9.794ng/µL et 2000 fmol/µL (plutôt que 2042). Cela correspond à 20.000 pmol/L.

Pour obtenir un point haut de la gamme (20pM), il faut le diluer 1000 fois (1*10 et 1*100 par ex.).

Le nombre de copie a été calculé selon la page indiqué plus bas (protocoles réalisés)

9.764(ng/µL)*2.042(fmol/ng)*10^-15(mol/fmol)*6.022*10^23 = 1.2044*10^10 copies/µL

Soit 1.2044*10^7 copies/µL pour le point haut de la gamme à 20pM

 

Protocoles réalisés (Si Applicable) :

https://eu.idtdna.com/pages/education/decoded/article/tips-for-working-with-gblocks-gene-fragments

en complément, petit document sur la qPCR.

Résultats :

Pour applications/Technos :

Validation Technique : Oui/non

Pour automates :

Qualification Opérationnelle Validée : Oui/Non

Qualification de Performance Validée : Oui/Non

 

Conclusions :

Passage en prestation CPG : Oui/Non

Kestafé/Mode Opératoire rédigé (si applicable) : Oui/Non (Lien vers Kestafé/Mode Opératoire)

 

Documents Externes (publications, manuels, protocoles fournisseurs, …) :

Suivi du projet (si applicable : amélioration, ajustement, …) :

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